微生物的培养与应用

课题一微生物的实验室培养

一、培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。

1、种类·培养基按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。

·按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。

·按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。

选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。

鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。

2、、化学成分包括：水、无机盐、碳源、氮源（有些可加生长因子、维生素）等。

·碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。

·氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）、蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。

·培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件。

3、配置原则

（1）目的明确：

（2）营养物质要协调，注意各营养物质的浓度和比例

（3）PH要适宜，各种微生物适宜生长的PH值范围不同。

二、无菌技术：消毒和灭菌

1、消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。

消毒方法：常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。

2、灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。

3、灭菌方法：

①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；

②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱；

③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。

④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。

三、实验操作

（一）、制作牛肉膏蛋白胨固体培养基方法步骤：

计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。

5、倒平板操作的讨论

①培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？

答：可用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。

②为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

③平板冷凝后，为什么要将平板倒置？

答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

④在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。

（二）、纯化大肠杆菌

1、微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

2、用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。

3、平板划线操作的讨论：

①为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

②在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？

答：以免接种环温度太高，杀死菌种。

③在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

4、涂布平板操作的讨论

涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，接种应如何进行无菌操作？

提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。

（三）、恒温箱培养：不同的微生物培养温度不同，一般是37°C恒温箱中，培养12~14小时。

（四）、菌种的保存

（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

①临时保藏方法

将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。

②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。

（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。

13、疑难解答

（1）微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。

（2）确定培养基制作是否合格的方法：将未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。

课题二土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

尿素：是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶，尿素最初是从人的尿液中发现的。

一、研究思路

1、筛选菌株

思路：寻找目的菌株时要根据它对生存环境的要求到它适应生长的环境中去寻找。

（1）实验室中微生物的筛选应用的原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

（2）选择性培养基

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

（3）配制选择培养基的依据

根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。

2、统计菌落数目

（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。

（2）采用稀释涂布平板法计数的注意事项：①一般选取菌落数在30~之间的平板进行计数②本法仅限于形成菌落的微生物。

（3）设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。

3、实验设计

（1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。

（2）制备培养基：制备一尿素为唯一氮源的选择培养基

（3）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～之间、适于计数的平板。

·测定土壤中细菌的数量，一般选用、、

·测定放线菌的数量，一般选用、、

·测定真菌的数量，一般选用、、、

（4）取样涂布

（5）微生物的培养与观察

不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。

（6）细菌的计数

如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值。

每克样品中的菌落数=（C/V）×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数

“微生物的培养与应用”知识归纳

　　一、知识归纳

1、培养基的分类和应用

2、消毒与灭菌的区别

3、三种常用灭菌方法的比较

4、微生物的纯化培养

包括培养基的制备和纯化微生物两个阶段，纯化微生物时常用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法。

平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后，就可以得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。

稀释涂布平板法：将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。

微生物的培养与应用相关知识拓展

发酵工程，是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。

答案

例题1．现有一种能生产甲硫氨酸的M菌，但产量很低，而且当培养液中甲硫氨酸的含量达到最大值后，继续培养，甲硫氨酸含量会迅速下降。这是由于甲硫氨酸的积累反过来抑制了其合成。用紫外线照射可选育得到能抗甲硫氨酸抑制的高产新菌株。下列有关选育过程的表述，不正确的是

A．这种新菌株的选育方法属于用物理因素诱导的诱变育种

B．M菌培养液中甲硫氨酸的含量达到最大值后又不断减少是反馈调节的结果

C．用紫外线照射M菌的同时，还应在其培养基中添加甲硫氨酸

D．该选育过程中采用的培养基是液体培养基

答案D

例题2.(16分)焦化厂活性污泥中富含难降解的有机物苯甲酰胼,是当前焦化行业环保治理的难点。某同学通过查阅资料发现可通过细菌生物降解方法处理焦化厂污染物。请回答下列有关问题：

(1)目的菌的筛选：选择目的菌应该从_________中筛选，在配制培养基时仅加入_________作为碳源，从功能上讲该培养基属于_________培养基,所选目的菌的同化作用类型是________。

(2)优质菌株的驯化：欲要选出高效降解污染物的优质菌株，需采用逐步提高_________的方法驯化目的菌，培养出的目的菌株经稀释涂布分离后得到_________以备鉴定和使用。

(3)优质菌株降解污染物能力的测定：将分离得到的优质菌株_________到经过_________处理的污染物液体培养基中，在适宜条件下培养,一定时间后，测定残余污染物的浓度。

答案（16分）（1）焦化厂活性污泥（焦化厂污染物）苯甲酰肼选择异养型（2）苯甲酰肼浓度单一菌落（3）接种灭菌

例题3．下列关于微生物培养和利用的叙述不正确的是

A．利用稀释涂布平板法只能分离微生物不能对微生物进行计数

B．接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单菌落

C．以尿素为唯一氮源且含酚红的培养基可选择和鉴别尿素分解菌

D．用大白菜腌制泡菜的过程中亚硝酸盐含量变化是先增加后减少

答案A

例题4.（16分）孔雀石绿(C23H25N2Cl)常用作纺织业的染料，也可用作水产养殖业的杀菌驱虫剂。但它具有高毒性、高残留的危害，因此对孔雀石绿废水的处理已成为环境科学领域

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