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今天推荐的是暨南大学药学院中药现代化与创新药物开发教育部国际合作实验室在年11月发表于ActaPharmaceuticaSinicaB（IF：11.，Q1）的一篇文章，通讯作者是SanfangTu教授和ZhangZhang教授。

研究背景

慢性髓系白血病(CML)是一种血液系统恶性肿瘤，其特征为费城染色体(Ph+)的发生以及由此产生的致癌基因Bcr-Abl。最近发展起来的蛋白质水解-靶向嵌合体(proteolyysis-targetchimeras,PROTACs)利用杂双功能小分子实现对目标蛋白的选择性降解。当PROTACs与靶蛋白和E3泛素连接酶结合形成三元复合物后，靶蛋白首先被E2连接酶泛素化，然后被26S蛋白酶体降解。

摘要部分

Bcr-Abl苏氨酸至异亮氨酸(TI)复原突变诱导的耐药仍是慢性粒细胞白血病(CML)治疗的一个尚未满足的临床挑战。Bcr-AblTI蛋白的化学降解已成为克服耐药性的一种潜在策略。在此，作者首次描述了一种基于GZD的新型选择性Bcr-AblTI蛋白水解靶向嵌合(PROTAC)降解物的设计、合成和评价(本小组报道为Bcr-AblTI抑制剂)。其中具有6个成员碳链的降解剂7o与pomalidomide在nmol/L和nmol/L时的DR值分别为69.89%和94.23%，IC50值为26.8±9.7nmol/L。此外，7o在体内对Ba/F3-Bcr-AblTI异种移植模型也有显著的肿瘤消退。

研究内容

1.Bcr-AblTI降解剂的设计

作者已经确定了GZD作为一种新的口服生物可用性候选药物，对广泛的Bcr-Abl突变具有效力，包括复原TI和p-loop突变(图2A)。GZD于年获国家药品监督管理局(NMPA)批准进行临床试验研究，并于年进入二期研究(NCT)。分子对接显示，GZD以II型模式与ATP结合袋结合，甲基哌嗪基团暴露于溶剂区，在溶剂区适合连接E3连接酶配体进行PROTACs设计(图2B)。从图1可以看出，Bcr-AblPROTACs的设计采用了三种E3连接酶CRBN、VHL和细胞凋亡抑制蛋白1(cIAP1)，乙烯二氧和碳链两种连接物。因此，作者通过将上述连接酶配体和不同长度的连接子栓接在GZD上，设计了PROTACs双功能化合物，探究其降解能力。此外，还利用金刚烷基作为疏水标签，导致目标物被UPS错误折叠和降解，被用于PROTACs设计中。

图1.先前报道的Bcr-AblPROTACs

图2.Bcr-AblTIPROTACs的设计

研究结论：通过将连接酶配体和不同长度的连接子栓接在GZD上，设计了Bcr-AblTIPROTACs双功能化合物。

2.化学合成

标题PROTACs的合成如方案1-3所示。PMB保护的POI配体18的合成路线见方案1。简单地说，先将原料8溴化得到溴9，然后在碱性条件下用N-Boc-哌嗪处理，再用Fe/NH4Cl还原得到苯胺11。在钯催化下处理3-碘苯甲酸甲酯7得到Sonogashira偶联产物13，该偶联产物再与保护PMB的5-溴-1H-吡唑罗[3,4-b]吡啶(15)偶联得到炔16。与11和16缩合得到酰胺18。CRBN配体共轭连接剂(22a-22g,26和29a-29h)和连接剂(32)的合成如方案2所示。通过与CRBN配体(波马度胺、来那度胺和沙利度胺)反应，得到了22a-22g、26和29a-29h的连接体。所研究的PROTACs一般合成路线如方案3所示。化合物18与各种CRBN连接物缩合，再经TFA脱保护，得到相应的PROTACs7a-7c和7g-7s(方案3A)。18进一步被叔丁基3-(2-(甲氧基)乙氧基)丙酸21b取代，得到中间产物30，去掉保护基得到31。31与VHL配体和金刚烷胺的缩合可使PROTACs获得7d和7f(方案3B)。此外，通过18的取代和脱保护，再与CIAP配体进一步缩合得到了PROTAC7e(方案3C)。

方案1.PMB保护的POI配体18的合成

方案2.CRBN配体共轭偶联剂的一般合成(22a-22g,26和29a-29h)

方案3.制备PROTACs的一般过程(7a-7s)

研究结论：化合物18与各种CRBN连接物缩合，再经TFA脱保护，得到相应的PROTACs7a-7s。

3.结构降解关系

由于乙二氧基连接剂已被报道对Bcr-AblPROTAC设计有效，作者首先将GZD与CRBN(pomalidomide、来那度胺和沙利度胺)、VHL、cIAP1E3配体和疏水标签金刚烷基通过8个成员(含2个PEG)长度的乙二氧基连接，得到PROTACs7a-7f(表1)。在表达Bcr-AblTI的Ba/F3细胞中，分别以0，33.3，和nmol/L浓度处理24h，首次检测了设计的Bcr-AblPROTACs的降解效率。结果发现，只有化合物7a对Bcr-AblTI表现出中等的降解潜力，降解速率(DR)为39.01%，效价是GZD的2倍(表1)。而化合物7a对表达Bcr-Abl的K细胞在处理24小时后没有表现出明显的降解。采用CCK-8试验进一步检测7a-7f对CML细胞株K、Ba/F3Bcr-AblWT和Ba/F3Bcr-AblTI的抗增殖活性。结果还表明，化合物7a对Ba/F3TI细胞系具有最强的抗增殖活性，与降解效率相对应。这些数据表明，CRBN配体pomalidomide可用于Bcr-AblTI降解剂的设计。值得注意的是，化合物7a-7f对K和Ba/F3Bcr-AblWT细胞株的增殖抑制作用可以解释为GZD对Bcr-AblWT的抑制作用。

表1.不同E3连接酶配体设计的PROTACs的降解率(DR)和细胞抑制率(IC50)

研究结论：化合物7a对Bcr-AblTI表现出中等的降解潜力，降解速率(DR)为39.01%，效价是GZD的2倍，化合物7a对Ba/F3TI细胞系具有最强的抗增殖活性，与降解效率相对应。

进一步检查链接器长度对化合物的影响,使用复合7a作为一个线索,作者合成和评价化合物7g-7k通过缩短或延长的长度7a’s链接器1和3-6PEG链接器(表2)。结果表明，含3个PEG的7h的降解活性比7a提高了2倍(DR=78.34%)，而其他化合物7g和7i-7k则不同程度地降低了降解活性(表2)。出乎意料地，相对于7a，7h对Ba/F3Bcr-AblTI细胞系的抗增殖活性没有显著提高，这可能与降解剂的渗透性有关。然而，结果表明，缩短或过度延长连接对PROTACs的降解能力有不利影响，化合物7h与含3PEG的连接剂A的降解效果最强。

考虑到Bcr-Abl降解剂的设计中也采用了纯碳链，设计并合成了一系列具有2-10长碳链的新型Bcr-AblTI降解剂7l-7t。从表2中可以看出，在衍生物中，生成的6成员碳链化合物7o在nmol/L和nmol/L时的DR值分别为69.89%和94.23%，对Ba/F3Bcr-AblTI细胞的IC50值为26.8±9.7nmol/L。当碳的长度缩短或延长时(如7l-7n和7p-7t)会导致降解效率不同程度的降低(表2)。此外，值得注意的是，虽然化合物7m、7n和7p对Ba/F3Bcr-AblTI细胞的抗增殖活性与7o相当，但它们仍表现出微弱的降解作用，而化合物7o显著降低Bcr-AblTI蛋白水平，在Ba/F3Bcr-AblTI细胞降解浓度(DC50)值为.7±16.3nmol/L。

表2.不同连接子的设计的PROTACs的降解率(DR)和细胞抑制率(IC50)

研究结论：缩短或过度延长连接对PROTACs的降解能力有不利影响，化合物7h与含3PEG的连接剂A的降解效果最强。采用纯碳链，化合物7o显著降低Bcr-AblTI蛋白水平。

4.降解机制研究

接下来，作者进行了时间-过程研究，以评估化合物7o在表达Bcr-ABlTI的Ba/F3细胞中降解Bcr-ABlTI的时间依赖性效应。免疫印迹分析显示，7o以时间依赖的方式引起Bcr-AblTI蛋白的降解(图3A)。在nmol/L7o处理6h后，显著降低了Bcr-AblTI蛋白水平，而在8-10h时出现钩效应。7o处理24h后，降解达到最大值。然而，7o在K细胞中显示出不同的降低Bcr-AblWT的趋势，nmol/L处理36小时后Bcr-AblWT显著降低(图3B)。Ba/F3Bcr-AblTI和K细胞中降解方式不同可能与E3连接酶的不同状态有关。

为了阐明7o诱导的Bcr-AblTI降解机制，作者进一步研究了蛋白酶体在蛋白降解过程中的作用。Ba/F3Bcr-AblTI细胞用20μmol/L蛋白酶体抑制剂MG预孵育，然后分别用nmol/L和nmol/L的7o处理24h。MG可以成功挽救7o诱导的Bcr-AblTI降解(图3C)。共免疫沉淀(Co-IP)数据表明，7o诱导的Bcr-AblTI降解是由CRBNE3泛素途径介导的(图3D)。

图3.PROTAC7o在Ba/F3Bcr-AblTI中的降解机理研究

研究结论：PROTAC7o在Ba/F3Bcr-AblTI中是由CRBNE3泛素途径介导的。

5.化合物7o的体内抗肿瘤作用

为了评价化合物7o的体内药效，作者首先通过单次腹腔注射(20mg/kg)来评价7o的体内药代动力学特性。如图4C所示，高血浆浓度可维持超过48小时，预计在体内研究中足以诱导Bcr-Abl降解。化合物7o在Ba/F3Bcr-AblTI异种移植瘤模型中进一步检测其体内抗肿瘤作用。

连续10天，每2天腹腔注射1次vehicle或

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